大型共價連接熒光和金納米粒子免疫探針

FluoroNanogold™ 探針含有熒光標記和與靶向分子共價連接的Nanogold®簇，已成功用于相關(guān)熒光和電子顯微鏡 (EM) [1]。然而，納米金很小（1.4 nm），需要銀或金增強才能可視化[2]。與較大的膠體金制劑相比，這會產(chǎn)生更大的尺寸變異性。銀增強可能會導致非特異性背景；銀可以通過四氧hua鋨 (OsO ₄ ) 固定進行化學蝕刻，導致信號丟失[2]。我們已經(jīng)制備了用于相關(guān)顯微鏡的共價連接組合熒光探針和較大的金納米顆粒探針，可以通過電鏡直接觀察，無需自動金相增強。使用自組裝涂層對直徑為 2 nm 至 40 nm 的金納米顆粒進行穩(wěn)定和功能化，該涂層包含疏水性螯合硫醇結(jié)構(gòu)域，用于將金表面與水介質(zhì)密封，以及親水性末端官能團（聚乙二醇，PEG），使金納米顆粒具有生物相容性。金納米粒子并實現(xiàn)位點特異性共價探針綴合。這提供了高穩(wěn)定性以及表面特性和共軛反應(yīng)的廣泛選擇。

5 nm 金納米顆粒的制備方法是，在增溶性非官能化硫醇和受保護的胺官能化硫醇的混合物存在下，用硼氫hua鈉直接還原金 (III) 鹽水溶液，然后使用蔗糖密度梯度 (10-30%) 進行純化超速離心（Ti-41 轉(zhuǎn)子，26,000 rpm，45 分鐘，5 ℃；距離頂部約 4 厘米的強烈紅色帶包含 5 nm 金）。通過在鹽酸甲醇中脫保護制備胺功能化的金顆粒。通過與商業(yè) N-羥基琥珀酰亞胺基-(NHS) Cy-5.5 熒光染料反應(yīng)證明了特異性反應(yīng)性。該綴合物通過 Superose-12 尺寸排阻色譜進一步純化（圖 1）。這種尺寸的不穩(wěn)定顆粒會被 0.1 M 氯化鈉沉淀，但即使在 1.0 M 氯化鈉溶液中，涂覆的顆粒仍保持分散和懸浮狀態(tài)。將它們反復離心并全重懸，不留下任何固體沉淀；對常規(guī)蛋白質(zhì)或大分子穩(wěn)定的膠體金綴合物進行相同的處理總是會導致部分組分損失，形成無法重懸的不溶性沉淀。

通過將 NHS 和馬來酰亞胺活化的 5 nm 金顆粒分別與二抗分子 IgG 和 F(ab') 共價連接來制備組合 5 nm 金-二抗 -Alexa Fluor 594 綴合物。然后，NHS 修飾的 Alexa Fluor 594 染料與綴合物發(fā)生反應(yīng)。使用蔗糖密度梯度超速離心純化產(chǎn)物，然后如上所述進行凝膠過濾。使用抗兔-F(ab')綴合物作為針對多克隆兔抗紅細胞抗體的二級探針來標記懸浮液中的綿羊紅細胞，并使用 Nikon G-2A 濾光片組通過熒光顯微鏡觀察標記情況（圖2）。抗小鼠 IgG 綴合物用作二級探針，與小鼠抗人 AE1/AE3 初級探針一起使用，在人扁桃體組織中產(chǎn)生清晰的細胞角蛋白染色（圖 3 ）。熒光金綴合物的相對量子產(chǎn)率為相應(yīng)商業(yè)染料標記二抗的 22-35%。