用  途：用于大鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中羥脯氨酸(Hyp)測定。

工作原理

本試劑盒采用的是生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA) 測定樣品中 大鼠羥脯氨酸(Hyp)水平。向預先包被了大鼠羥脯氨酸(Hyp)單克隆抗體的酶標孔 中加入大鼠羥脯氨酸(Hyp)，溫育；溫育后，加入生物素標記的抗 Hyp 抗體。再 與鏈霉親和素-HRP 結(jié)合，形成免疫復合物，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的 酶，然后加入底物 A、B，產(chǎn)生藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色 的深淺與樣品中大鼠羥脯氨酸(Hyp)的濃度呈正相關(guān)。

試劑盒組成

需要而未提供的試劑和器材

1．  37℃恒溫箱。

2．  標準規(guī)格酶標儀。

3．  精密移液器及一次性吸頭

4．  蒸餾水，

5．  一次性試管

6．  吸水紙

注意事項

1．  從 2-8℃取出的試劑盒，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少 30 分鐘。酶標包 被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

2．  各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差

3． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

4．  為避免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和封板膜。

5．  不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

6．  底物 B 對光敏感，避免長時間暴露于光下。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下 用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少 0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡 1-2 分鐘。根據(jù)需 要，重復此過程數(shù)次。

自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中

標本要求

1．不能檢測含NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的 (HRP) 活性。

2．標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應盡快進行實 驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。

操作程序

1. 標準品的稀釋： (本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小

試管中進行稀釋。)

2. 根據(jù)代測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白 孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復孔的盡量做復孔。

3. 加樣：1) 空白孔，空白對照孔不加樣品，生物素標記的抗 Hyp 抗體，鏈霉 親和素-HRP，只加顯色劑 A&B 和終止液，其余各步操作相同；2) 標準品孔： 加入標準品 50ul，鏈霉親和素-HRP50ul(標準品中已事先整合好生物素抗體， 故不加)；3) 代測樣品孔：加入樣本 40ul，然后各加入抗 Hyp 抗體 10ul、 鏈霉親和素-HRP50ul，蓋上封板膜，輕輕震蕩混勻，37℃溫育 60 分鐘。

4. 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用。

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后 棄去，如此重復 5 次，拍干。

6. 顯色：每孔先加入顯色劑A50ul，再加入顯色劑 B50 μ l，輕輕震蕩混勻，37℃ 避光顯色 15 分鐘.

7. 終止：每孔加終止液 50 μ l，終止反應 (此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。

8. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度 (OD 值) 。  測定應 在加終止液后 10 分鐘以內(nèi)進行。

9. 根據(jù)標準品的濃度及對應的OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù) 樣品的OD 值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。也可以使用各種應用軟 件來計算。

操作程序總結(jié)：

1.準備試劑，樣品和標準品

2.加入準備好的樣品和標準品，生物素標記的二抗和酶標試劑，37℃反應60分鐘

3.洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色15分鐘

4.加入終止液

5.10分鐘內(nèi)讀OD值

6.計算

試劑盒性能：

1.樣品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù) R 值為 0.92 以上。

2.批內(nèi)與批間應分別小于9%和 15%

檢測范圍：

檢測范圍：0-40μg/L。

保存條件及有效期：

保存：2-8℃。

有效期：6 個月(2-8℃)。