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Ancell抗CD64（FcRI）F（ab'）2用于阻斷調(diào)理血小板的吞噬作用
本研究著眼于抗血小板抗體糖基化對(duì)輸血患者巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬清除能力的影響?？笴D64單克隆抗體的F（ab'）2用作體外吞噬阻斷對(duì)照。
“單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞用不同糖基化的抗HLA hIgG1調(diào)理的血小板的吞噬作用”Thijs L，Gesture Vidarsson等。
單核細(xì)胞來(lái)源巨噬細(xì)胞用不同糖基化的抗HLA hIgG1調(diào)理的血小板的吞噬作用
免疫介導(dǎo)的血小板難治性 （PR） 仍然是血小板輸注情況下的一個(gè)重大問(wèn)題，主要由針對(duì) I 類人白細(xì)胞抗原 （HLA） 的同種異體抗體的存在引起。用這些同種抗體調(diào)理供體血小板可通過(guò)多種機(jī)制（包括抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用 （ADCP））在輸血后快速清除。有趣的是，并非所有同種異體免疫患者都會(huì)對(duì)不匹配的血小板輸注產(chǎn)生PR，這表明患者之間HLA特異性IgG反應(yīng)存在差異。以前，我們觀察到抗HLA抗體的糖基化譜在PR患者之間差異很大，特別是在Fc半乳糖基化，唾液酸化和巖藻糖基化方面。在目前的研究中， 我們研究了不同F(xiàn)c糖基化模式對(duì)單核細(xì)胞來(lái)源的人巨噬細(xì)胞吞噬調(diào)理血小板的影響，已知對(duì)補(bǔ)體沉積和FcγR結(jié)合的影響。我們發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞來(lái)源的M1巨噬細(xì)胞對(duì)抗體和補(bǔ)體調(diào)理的血小板的吞噬作用不受這些定性IgG-聚糖差異的影響。
血小板輸注是一種經(jīng)常給藥的治療方法，可降低血小板減少癥患者的死亡率和出血性并發(fā)癥。血小板輸注的一個(gè)主要問(wèn)題是血小板難治性（PR），這是指多次血小板輸注后血小板計(jì)數(shù)增加不足。PR 的發(fā)病率范圍為 5%-15%，因患者特征和血小板制品制備而異 [報(bào)價(jià)單1–4].在大約 20% 的 PR 病例中，血小板清除是免疫介導(dǎo)的，主要是由針對(duì) I 類人白細(xì)胞抗原 （HLA） 的同種抗體的存在引起，偶爾還有人血小板抗原 （HPA） [報(bào)價(jià)單5–9].用這些同種抗體調(diào)理供體血小板可在輸血后不久通過(guò)抗體依賴性細(xì)胞毒性 （ADCC）、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性 （CDC） 和/或抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用 （ADCP） 導(dǎo)致清除 [報(bào)價(jià)單10–16].目前對(duì)于大量輸血的同種異體免疫患者，目前的主要管理策略是廣泛匹配血小板輸注產(chǎn)品，以防止 PR 和隨后的更差臨床結(jié)局 [報(bào)價(jià)單7–9].有趣的是，并非所有同種異體免疫患者都會(huì)因血小板輸注不匹配而發(fā)生 PR [報(bào)價(jià)單17,報(bào)價(jià)單18]，提示患者之間HLA特異性IgG反應(yīng)的定性特征差異。
所有 IgG 分子都含有保守的 N-位于Fc區(qū)位置297的連接聚糖，影響抗體的結(jié)構(gòu)和功能。該聚糖由 N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和甘露糖殘基，可以通過(guò)巖藻糖，平分GlcNAc和最多兩個(gè)半乳糖殘基拉長(zhǎng)，兩者都可以被唾液酸殘基覆蓋?？贵wFc糖基化變化很大，之前在感染和同種異體免疫的情況下已經(jīng)描述了改變的模式，已知這些改變會(huì)影響抗體效應(yīng)功能，從而影響相關(guān)免疫應(yīng)答的進(jìn)展[報(bào)價(jià)單19–27].例如，巖藻糖殘基的缺失導(dǎo)致抗體與FcγRIIIa/b的結(jié)合親和力增加，這可能導(dǎo)致相關(guān)效應(yīng)功能增加，例如ADCC和ADCP [報(bào)價(jià)單19–22,報(bào)價(jià)單25,報(bào)價(jià)單28,報(bào)價(jià)單29].此外，半乳糖基化與補(bǔ)體活化特別相關(guān)[報(bào)價(jià)單21,報(bào)價(jià)單24,報(bào)價(jià)單30,報(bào)價(jià)單31].我們和其他人最近表明，半乳糖基化通過(guò)增強(qiáng)的六聚化增加了抗體激活經(jīng)典補(bǔ)體途徑的能力，這反過(guò)來(lái)又增加了補(bǔ)體沉積和CDC活性[報(bào)價(jià)單23,報(bào)價(jià)單30].唾液酸化略微增強(qiáng)補(bǔ)體活化，進(jìn)一步增強(qiáng)[報(bào)價(jià)單21,報(bào)價(jià)單23,報(bào)價(jià)單32]，而平分GlcNAc對(duì)補(bǔ)體活化和FcγR結(jié)合均無(wú)影響[報(bào)價(jià)單21].
之前，我們表征了在接受血小板輸注的血液腫瘤患者中檢測(cè)到的抗HLA I類抗體的糖基化譜[報(bào)價(jià)單33]和被診斷為 PR 的患者 [報(bào)價(jià)單20].抗HLA IgG特異性糖基化譜在患者之間差異很大。對(duì)于大多數(shù)患者，我們觀察到與總IgG相比，HLA特異性IgG的Fc半乳糖基化和唾液酸化增加。此外，少數(shù)患者（35 名患者中有 2 名）也產(chǎn)生了巖藻糖基化水平極低的抗 HLA 抗體 [報(bào)價(jià)單33].
在同種異體免疫和 PR 的背景下，輸注的血小板主要被認(rèn)為是在用抗 HLA 或 -HPA 同種抗體調(diào)理后被脾臟中的單核巨噬細(xì)胞清除 [報(bào)價(jià)單8,報(bào)價(jià)單10,報(bào)價(jià)單11,報(bào)價(jià)單13,報(bào)價(jià)單34,報(bào)價(jià)單35].存在幾種途徑，其中吞噬細(xì)胞可以通過(guò)非調(diào)理和調(diào)理受體檢測(cè)其吞噬作用靶標(biāo)。非調(diào)理受體對(duì)于識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（PAMP）和凋亡細(xì)胞至關(guān)重要，而調(diào)理受體識(shí)別用調(diào)理素靶向清除的細(xì)胞，例如IgG和補(bǔ)體成分。識(shí)別IgG的最重要和有效的吞噬受體是FcγRI（CD64），F(xiàn)cγRII（CD32）和FcγRIII（CD16）和補(bǔ)體受體3（CR3或CD11b / CD18），用于識(shí)別iC3b和C3d [報(bào)價(jià)單36,報(bào)價(jià)單37].脾巨噬細(xì)胞具有高表達(dá)的CR3，F(xiàn)cγRI，F(xiàn)cγRII和FcγRIII[報(bào)價(jià)單14,報(bào)價(jià)單38–41].當(dāng)血小板被IgG或補(bǔ)體成分調(diào)理時(shí)，血小板變得容易受到脾巨噬細(xì)胞表達(dá)的吞噬受體的結(jié)合，從而導(dǎo)致隨后的吞噬和破壞。血小板通過(guò)脾正弦的緩慢通過(guò)進(jìn)一步增強(qiáng)了這一過(guò)程[報(bào)價(jià)單7,報(bào)價(jià)單11,報(bào)價(jià)單14].然而，補(bǔ)體系統(tǒng)受累以及血小板內(nèi)在因素（如血小板凋亡和調(diào)理作用時(shí)活化）最近也被提出與 PR 中血小板存活率降低有關(guān) [報(bào)價(jià)單12,報(bào)價(jià)單15,報(bào)價(jià)單35,報(bào)價(jià)單42–45].
有趣的是，對(duì)于抗體Fc糖基化對(duì)巨噬細(xì)胞使用不同糖基化的抗HLA同種抗體調(diào)理作用時(shí)血小板清除的影響知之甚少。特別是鑒于最近關(guān)于抗體Fc糖基化對(duì)FcγR結(jié)合和補(bǔ)體沉積的影響的發(fā)現(xiàn)，重要的是要更深入地了解抗體Fc糖基化對(duì)同種異體免疫時(shí)PR中涉及的清除機(jī)制的影響。在目前的研究中，我們研究了已知影響補(bǔ)體沉積和FcγR親和力的不同F(xiàn)c糖基化模式對(duì)單核細(xì)胞來(lái)源的人巨噬細(xì)胞調(diào)理化血小板吞噬的影響。使用單核細(xì)胞來(lái)源的M1巨噬細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兙哂懈弑磉_(dá)水平的FcγR和CR3， 人脾巨噬細(xì)胞也高度表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)改變Fc糖基化譜增加補(bǔ)體沉積和/或FcγRIIIa/b親和力并不影響人單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞對(duì)IgG調(diào)理化血小板的吞噬作用。 體外 型。
在書面知情同意后，從匿名Sanquin獻(xiàn)血者獲得的血沉棕黃層中分離出單核細(xì)胞。血小板是從匿名健康志愿者的檸檬全血中分離出來(lái)的，并得到知情的書面同意。單核細(xì)胞和血小板不是從同一個(gè)個(gè)體獲得的。所有程序均由Sanquin道德咨詢委員會(huì)批準(zhǔn)，并符合赫爾辛基宣言和荷蘭法規(guī)。
本研究中使用的抗HLA單克隆抗體的生產(chǎn)和糖工程技術(shù)已被詳細(xì)描述[報(bào)價(jià)單46–52].簡(jiǎn)而言之，所有抗HLA mAb可變區(qū)域的蛋白質(zhì)序列用于組裝編碼全人IgG1和PG LA LA Fc突變體（P329 G，L234A和L235A）的pcDNA3.1表達(dá)載體，這些突變體不能結(jié)合補(bǔ)體和FcγR[報(bào)價(jià)單53].表達(dá)載體用于我們內(nèi)部HEK Freestyle系統(tǒng)中重組抗體的生產(chǎn)。為了獲得具有某些所需聚糖譜的抗體，在轉(zhuǎn)染之前/期間使用化學(xué)抑制劑2-脫氧-2-氟-L-巖藻糖（2FF，碳合成物）來(lái)減少fc巖藻糖基化和5 mM D-半乳糖（Sigma Aldrich），并編碼酶β-1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1（B4GALT1）和β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶1（ST6GALT1）的構(gòu)建體，以增加半乳糖基化和唾液酸化。轉(zhuǎn)染后6天純化單克隆抗體，并進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜的IgG Fc糖基化分析[報(bào)價(jià)單46,報(bào)價(jià)單47,報(bào)價(jià)單54].
如前所述，通過(guò)IBIS M×96（IBIS技術(shù)）上的表面等離子體共振（SPR）評(píng)估抗體與人FcγR類別的結(jié)合[報(bào)價(jià)單55,報(bào)價(jià)單56].使用連續(xù)流動(dòng)微量觀察儀（Wasatch Microfluidics）將所有C端生物素化的hFcγR點(diǎn)到單個(gè)SensEye G-鏈霉親和素傳感器（Ssens）上，該傳感器允許同時(shí)測(cè)量每種抗體與所有hFcγR的結(jié)合親和力。生物素化的hFcγR以三倍稀釋度點(diǎn)樣，hFcγRIIa-H131，hFcγRIIIa-F158，hFcγRIIIb-NA1和hFcγRIIIb-NA2從30 nM到1 nM，hFcγRIIa-R131和hFcγRIIb的稀釋范圍為10 nM至0.3 nM，在補(bǔ)充有0.075%吐溫-80（VWR，M126-100 ml），pH 7.4的PBS中，hFcγRIIIa-V158的范圍為100 nM至3 nM。每個(gè)樣品后用10nM Gly-HCl，pH 2.0進(jìn)行再生。解離常數(shù)（KD）使用Rmax = 500的平衡擬合計(jì)算。 所有結(jié)合數(shù)據(jù)的分析和計(jì)算均使用洗滌器軟件版本2（生物軟件）和Excel完成。
使用CD14+磁性微珠分離（Miltenyi Biotec）從血沉棕黃層衍生的PBMC中分離單核細(xì)胞，隨后冷凍直至如前所述進(jìn)一步使用[報(bào)價(jià)單44,報(bào)價(jià)單57].采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定單核細(xì)胞純度，為>90%。單核細(xì)胞分化為單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞，如所述[報(bào)價(jià)單58].簡(jiǎn)而言之，單核細(xì)胞在第0天解凍并在24孔培養(yǎng)板（0.25x106 每孔單核細(xì)胞）在 IMDM 1640（龍沙）中存在 10 ng/mL 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF、CellGenix），含有 10% 胎牛血清 （Bodinco） 100 U/mL 青霉素和 100 U/mL 鏈霉素（均為 Gibco），CO 為 5% CO2 37°C. 細(xì)胞共培養(yǎng)9天，培養(yǎng)第3天加入新鮮培養(yǎng)基和GM-CSF。
通過(guò)離心枸櫞酸全血，從富血小板血漿（PRP）中分離出具有已知HLA分型的健康志愿者的血小板 g 20分鐘，使用前面描述的方法進(jìn)行優(yōu)化以避免血小板活化[報(bào)價(jià)單12,報(bào)價(jià)單16].此后，10 體積% ACD（酸性檸檬酸鹽葡萄糖，85 mM Na3-檸檬酸鹽·2 H2O， 71 mM檸檬酸·H2O和111mM D-葡萄糖）加入。PRP離心（850 g 8分鐘），并用洗滌緩沖液（WB;36mM檸檬酸·H2O，103 mM NaCl，5 mM KCl，5 mM EDTA，5.6 mM D-葡萄糖，pH 6.5）。將血小板濃度設(shè)置為6×108 PBS中的細(xì)胞/ mL，并在室溫下與3.75μM PKH26（西格瑪奧爾德里奇）在輥組上孵育20分鐘。加入10體積%FCS終止標(biāo)記過(guò)程，用WB洗滌標(biāo)記的血小板并重懸于PBS + 0.5%BSA中。5 × 106 將血小板與等體積的重組抗HLA抗體一起孵育，并在室溫下混合補(bǔ)體足夠的人血清30分鐘。對(duì)于某些條件，將血清在56°C下預(yù)孵育30分鐘以滅活補(bǔ)體。用PBS + 0.5%BSA + 5 mM EDTA洗滌血小板3次，并重懸于巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中。補(bǔ)體沉積（C3b）通過(guò)用抗補(bǔ)體C3b/iC3b-APC抗體克隆染色一小部分血小板來(lái)評(píng)估補(bǔ)體沉積（C3b）：3E7/C3b（1/250，生物傳奇）
對(duì)于吞噬作用測(cè)定，將調(diào)理的血小板在37°C下與同種異體巨噬細(xì)胞以1：40巨噬細(xì)胞：血小板比例孵育30分鐘。對(duì)于某些條件，將巨噬細(xì)胞在室溫下與10μg/ mL FcγR封閉抗體（抗CD16，抗CD32和/或抗CD64）和同種型對(duì)照預(yù)孵育30分鐘。抗CD64（克隆10.1，阻斷FcγRI）作為f（ab'）2片段從Ancell公司訂購(gòu)，而抗CD32（克隆AT10，阻斷FcγRIIa/b/c），抗CD16（克隆3G8，阻斷FcγRIIIa/b）和同種型（抗生物素）被克隆并生產(chǎn)為hIgG1 N297A P329 G，L234A和L235A，使它們無(wú)法結(jié)合C1q和FcγRs [報(bào)價(jià)單53].此后，用PBS洗滌細(xì)胞并使用130mMli多卡因（Sigma Aldrich）和10mM EDTA（默克）收獲。收獲后，將巨噬細(xì)胞保持在冰上，并用冰冷的PBS + 0.5%牛血清白蛋白（BSA，Sigma Aldrich）+ 2 mM EDTA（默克）洗滌，隨后用冰冷的PBS洗滌。收獲后，將細(xì)胞用3.7%多聚甲醛（Sigma Aldrich）在PBS中固定在室溫下15分鐘。接下來(lái)，用PBS + 0.5%BSA洗滌細(xì)胞，并使用APC標(biāo)記的抗HLA-DR（克隆L243，BD Biosciences）和BV421標(biāo)記的抗CD42a（克隆ALMA.16，BD Biosciences）染色20分鐘在PBS + 0.5%BSA的室溫下。用PBS + 0.5%BSA洗滌細(xì)胞，并使用BD LSR II流式細(xì)胞儀和成像流式細(xì)胞術(shù)（ImageStreamX Mark II成像流式細(xì)胞術(shù)，默克密理博）進(jìn)行分析。使用Flowjo v 10.8.1分析流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù); 基于FSC / SSC，單細(xì)胞和HLA-DR+對(duì)細(xì)胞進(jìn)行門控，之后對(duì)PKH26標(biāo)記的血小板和抗CD42a-BV421（PKH26+ CD42a-：吞噬;PKH+ CD42a+：結(jié)合的血小板;補(bǔ)充圖S3A）。使用IDEAS v6軟件分析成像流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)，涉及對(duì)門細(xì)胞的縱橫比強(qiáng)度/面積Ch01進(jìn)行門控，隨后對(duì)焦點(diǎn)細(xì)胞（梯度RMS Ch01）和HLA-DR+細(xì)胞進(jìn)行門控巨噬細(xì)胞，之后對(duì)PKH26標(biāo)記的血小板和抗CD42a-BV421陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行門控（補(bǔ)充圖S3B）。 使用IDEAS v6軟件分析成像流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)，涉及對(duì)門細(xì)胞的縱橫比強(qiáng)度/面積Ch01進(jìn)行門控，隨后對(duì)焦點(diǎn)細(xì)胞（梯度RMS Ch01）和HLA-DR+細(xì)胞進(jìn)行門控巨噬細(xì)胞，之后對(duì)PKH26標(biāo)記的血小板和抗CD42a-BV421陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行門控（補(bǔ)充圖S3B）。 使用IDEAS v6軟件分析成像流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)，涉及對(duì)門細(xì)胞的縱橫比強(qiáng)度/面積Ch01進(jìn)行門控，隨后對(duì)焦點(diǎn)細(xì)胞（梯度RMS Ch01）和HLA-DR+細(xì)胞進(jìn)行門控巨噬細(xì)胞，之后對(duì)PKH26標(biāo)記的血小板和抗CD42a-BV421陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行門控（補(bǔ)充圖S3B）。
統(tǒng)計(jì)分析在Windows版GraphPad Prism 8.02（263）中執(zhí)行。使用普通單因素方差分析和鄧尼特多重比較檢驗(yàn)分析條形圖。重要性水平設(shè)定為 p ≤ .05.*、**、*** 和 **** 表示統(tǒng)計(jì)顯著性 p 分別為<.05、≤.01、≤.001和≤.0001。
為了確定抗HLA同種抗體的Fc糖基化對(duì)補(bǔ)體和/或FcγR介導(dǎo)的血小板吞噬作用的影響，建立了監(jiān)測(cè)人單核細(xì)胞來(lái)源巨噬細(xì)胞吞噬血小板吞噬作用的系統(tǒng)。糖基化譜改變的抗HLA單克隆抗體（mAb）（補(bǔ)充圖S1A-C）如下所述[報(bào)價(jià)單46,報(bào)價(jià)單47]并進(jìn)行基于液相色譜-質(zhì)譜的IgG Fc糖基化分析，以確認(rèn)預(yù)期的糖基化曲線（補(bǔ)充圖S1D）。
將血小板與未修飾和糖工程化的抗HLA hIgG1 mAb（SN230G6、SN607D8和W6/32）在補(bǔ)體充足血清存在下孵育，從而實(shí)現(xiàn)抗體和補(bǔ)體調(diào)理。只有SN230G6和SN607D8抗體的組合導(dǎo)致強(qiáng)烈的C3b沉積，盡管泛HLA I類識(shí)別W6/32（補(bǔ)充圖S1B）自行引起補(bǔ)體沉積（補(bǔ)充圖S1E），與我們之前的觀察結(jié)果一致[報(bào)價(jià)單47].半乳糖基化和唾液酸化升高的抗體顯著增強(qiáng)了補(bǔ)體沉積。mAb的巖藻糖基化對(duì)補(bǔ)體沉積沒(méi)有影響（補(bǔ)充圖S1E）。PG LALA Fc突變體，不能結(jié)合C1q和FcγR[報(bào)價(jià)單53]，也沒(méi)有熱滅活血清（HI血清）導(dǎo)致C3b沉積（補(bǔ)充圖S1F）。通過(guò)SPR陣列評(píng)估了這些糖工程抗體與人FcγR的結(jié)合，證實(shí)了FcγRIIIa/b的親和力增加，而FcγRIIa/b的親和力差異沒(méi)有觀察到（補(bǔ)充圖S2）。
調(diào)理的PKH26標(biāo)記的血小板與單核細(xì)胞來(lái)源的M1樣巨噬細(xì)胞（圖 1A).這些分化的巨噬細(xì)胞表達(dá)所有類別的FcγR（FcγRI（CD64），F(xiàn)cγRII（CD32），F(xiàn)cγRIII（CD16））以及CR3（CD11b / CD18）（圖1B），所有參與吞噬作用的關(guān)鍵受體[報(bào)價(jià)單8,報(bào)價(jià)單11,報(bào)價(jià)單36,報(bào)價(jià)單37,報(bào)價(jià)單59].使用成像和常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定血小板的內(nèi)化（門控策略分別在補(bǔ)充圖S3A和3B中描述）。血小板特異性標(biāo)志物CD42a用于檢測(cè)巨噬細(xì)胞外部的血小板（圖1C).大多數(shù)血小板陽(yáng)性（PKH+）巨噬細(xì)胞是CD42a-。此外，使用成像流式細(xì)胞術(shù)顯示，大多數(shù)PKH+ CD42a +事件由同時(shí)具有吞噬作用（PKH + CD42a-）和結(jié)合（PKH+ CD42a +）血小板的巨噬細(xì)胞組成，表明總PKH+區(qū)室與血小板吞噬的定量相關(guān)（圖 1D-E 和補(bǔ)充圖S3A，下面板）。因此，通過(guò)常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)分析PKH+巨噬細(xì)胞的總區(qū)室以評(píng)估血小板吞噬作用，因?yàn)榕懦齈KH + CD42a +事件會(huì)導(dǎo)致吞噬效率的低估。
圖1. A) 監(jiān)測(cè)調(diào)理化血小板吞噬作用的實(shí)驗(yàn)裝置的示意圖概述：用GM-CSF將CD14 +單核細(xì)胞培養(yǎng)9天，以分化為單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞（MQ M1）。此后，巨噬細(xì)胞在有和沒(méi)有FcγR阻斷劑的情況下預(yù)先孵育。來(lái)自HLA-A2+供體的新鮮分離的血小板用PKH26標(biāo)記，并在補(bǔ)體充足或熱滅活（HI）血清存在下與未修飾和糖工程化的抗HLA單克隆抗體預(yù)孵育，用于抗體和補(bǔ)體調(diào)理。將巨噬細(xì)胞和血小板洗滌并在37°C下共孵育30分鐘，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和Imagestream進(jìn)行分析 B) 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析的單核細(xì)胞來(lái)源巨噬細(xì)胞表面補(bǔ)體受體3（Cd11b / cd18）和FcγR（FcγRI，F(xiàn)cγRII，F(xiàn)cγRIII）的表達(dá)水平。 C-E） 血小板的內(nèi)化是用 C) 常規(guī)和 D-E） 成像流式細(xì)胞術(shù)?？笴D42a-BV421染色與PKH26聯(lián)合用于鑒定附著在細(xì)胞外部的血小板。顯示了通過(guò)成像流式細(xì)胞術(shù)獲得的指示象限的代表性圖像。
與未調(diào)理的血小板（圖 2A，B).以抗體濃度依賴性方式觀察吞噬作用，吞噬細(xì)胞MQ的最大百分比為1μg/mL。盡管半乳糖基化和唾液酸化水平升高的糖工程mAb顯著增強(qiáng)了血小板上的補(bǔ)體沉積（補(bǔ)充圖S1E），但這些并沒(méi)有導(dǎo)致更高水平的后續(xù)吞噬作用（圖2C).此外，用非糖基化IgG調(diào)理，這增加了對(duì)FcγRIII的親和力（[報(bào)價(jià)單21]和補(bǔ)充圖S2），與未修飾的抗體（圖2C).此外，將血小板與單獨(dú)的未修飾抗HLA單克隆抗體SN230G6或SN607D8孵育可增強(qiáng)吞噬作用（補(bǔ)充圖S4A-B），并且不受抗體Fc聚糖修飾的影響（補(bǔ)充圖S4C-D）。與SN230G6 + SN607D8組合類似，與未調(diào)理的血小板相比，將血小板與泛HLA I類抗體W6/32孵育導(dǎo)致吞噬作用顯著增加（圖 2D，E).以抗體濃度依賴性方式觀察吞噬作用，不受任何抗體聚糖修飾（圖 2E，F(xiàn)).這些結(jié)果表明，觀察到的吞噬作用主要不是通過(guò)補(bǔ)體受體或FcγRIIIa/b介導(dǎo)的。
圖2. 單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞吞噬補(bǔ)體和抗體調(diào)理血小板 A） 絕對(duì)和 B) 在補(bǔ)體充足血清存在下，與不同濃度的未修飾的hIgg1抗HLA單克隆抗體（mAb）SN230G6 + SN607D8一起孵育的血小板吞噬相對(duì)水平 C) 在補(bǔ)體充足血清存在下，用未修飾和糖工程的hIgg1 SN230G6 + SN607D8 mAb預(yù)孵育的血小板之間的吞噬作用差異。 D) 絕對(duì)和 E) 在補(bǔ)體充足血清存在下，與不同濃度的未修飾的泛抗 HLA I 類 hIgg1 mAb W6/32 預(yù)孵育的血小板吞噬相對(duì)水平 F) 在補(bǔ)體充足血清存在下，用未修飾和糖工程hIgg1 W6 / 32 mAb預(yù)孵育的血小板之間的吞噬作用差異。 G-H） 在補(bǔ)體充足或熱滅活 （HI） 血清存在下，用 1 μg/ml 未修飾或 PG LA LA Fc 突變抗 HLA mAb（SN230G6+SN607D8 或 W6/32）預(yù)孵育的血小板的相對(duì)吞噬水平 A-H） 吞噬作用水平（%）定義為PKH26+巨噬細(xì)胞部分（Q1 + Q2）的百分比。數(shù)據(jù)表示在2-4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中使用的2-5個(gè)不同單核細(xì)胞供體的2個(gè)技術(shù)重復(fù)的平均值和SD，對(duì)于每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，還使用了不同的血小板供體。數(shù)據(jù)點(diǎn)的顏色表示不同的單核細(xì)胞供體。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)化，如圖所示，用1μg/ ml未修飾的抗HLAmAb孵育的血小板的吞噬作用水平設(shè)置為1。采用Dunnet多重比較檢驗(yàn)的普通單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。*p ≤ .05， ****p ≤ .0001 和 ns = 不顯著 .
與此一致，用HI血清調(diào)理的血小板不會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吞噬作用減弱（圖2G).然而，用PG LA LA Fc突變體進(jìn)行血小板調(diào)理作用顯著消除了吞噬作用（圖2G），提示吞噬作用依賴于 FcγR，但與補(bǔ)體無(wú)關(guān)。在W6/32中觀察到相同的趨勢(shì)，其吞噬作用似乎不受HI血清（圖2H).然而，必須注意的是，在補(bǔ)體充足血清存在的情況下，將血小板與未修飾的W6/32抗體孵育僅會(huì)導(dǎo)致低C3b沉積（補(bǔ)充圖S1E）。
為了初步評(píng)估哪種FcγR可能參與抗HLA調(diào)理血小板的吞噬作用，使用了FcγR阻斷抗體。雖然阻斷FcγRII或FcγRIII導(dǎo)致吞噬作用的減少可以忽略不計(jì)，但單獨(dú)阻斷FcγRI或與FcγRII和FcγRIII聯(lián)合阻斷，導(dǎo)致單核細(xì)胞衍生巨噬細(xì)胞對(duì)調(diào)理血小板的吞噬作用降低（補(bǔ)充圖S4E-F）。我們假設(shè)在阻斷FcγRI時(shí)，對(duì)于用低巖藻糖化抗體調(diào)理的血小板，對(duì)FcγRIII的親和力增加可能會(huì)變得明顯。引人注目的是，F(xiàn)cγRI阻斷抗體的存在似乎不會(huì)影響低巖藻糖基化W6/32抗體的吞噬作用（補(bǔ)充圖S4G）。
Ancell抗人Fc受體抗體，F(xiàn)ab，F(xiàn)（ab'）2，偶聯(lián)物
抗CD16 （FcgRIII）
抗CD32 （FcgRII）
抗CD64 （FcgRI）
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